EF03B-J2b 2016-01版
喹諾酮類
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物喹諾酮類藥物和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗喹諾酮類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留喹諾酮類藥物的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物喹諾酮類藥物的含量。
二、試劑盒特性
- 試劑盒靈敏度： 0.1ppb
- 孵育溫度： 25℃
- 孵育時間： 30min～15min
- 樣本檢測下限
組織 、血清 ········································ 1ppb
- 交叉反應(yīng)率
恩諾沙星（ENR） ·························· 100%
環(huán)丙沙星（CIF） ···························· 100%
氧氟沙星（OFL） ·························· 60%
奧索利酸（OXO） ··························· 116.86%
達氟沙星（DAN） ··························· 102.63%
諾氟沙星（NOR） ··························· 148.65%
洛美沙星（LOM） ·························· 86.24%
培氟沙星（PEF） ·························· 156.60%
依諾沙星（ENO） ··························· 98.97%
氟喹酸（FLU） ··························· 96.73%
麻保沙星（MAR） ·························· 110.63%
氨氟沙星（AMI） ··························· 98.86%
那氟沙星（NAD） ··························· 56.81%
- 樣本回收率
組織、血清 ································· 85±20%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔，一板12條 | |
2 | 標(biāo)準液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 0.1ppb |
0.3ppb | 0.9ppb | ||
2.7ppb | 8.1ppb | ||
3 | 酶標(biāo)記物 | 7ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 20X濃縮復(fù)溶液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：單道 20～200ul、單道100～1000ul、多道 250 ul
五、樣本前處理步驟
- 樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a） 實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（b） 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
- 樣本前處理需配制：
配液1 樣本復(fù)溶液
將20X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：19（1份濃縮復(fù)溶液+19份去離子水）進行稀釋。
- 樣本處理：
a）組織樣本處理方法
1、稱1.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；
2、加入10ml樣本復(fù)溶液，振蕩3min，4000r/min以上，15℃離心10min；
3、取上清50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：10
b）血清樣本處理方法
- 取50µl澄清的血清，加入450µl 樣本復(fù)溶液混合，混勻30S（如果血清樣本渾濁，將樣本于10℃，4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清，直至得到澄清的樣本）；
- 取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 10倍
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
- 測定前應(yīng)須知：
- 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
- 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
- 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
- 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
- 操作步驟：
- 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
- 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。
- 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
- 編號：將樣本和標(biāo)準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準品均需做2孔平行，并記錄標(biāo)準孔的樣本孔所在的位置。
- 加標(biāo)準品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
- 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
- 顯色：每孔加入底物A液50µl再加入底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。
- 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含喹諾酮類藥物量成負相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標(biāo)準液吸光度值分別是：0ppb為1.845； 0.1ppb為1.542；0.3ppb為1.130； 0.9ppb為0.635；2.7ppb為0.326； 8.1ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb - 8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb - 0.9ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物的實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以個標(biāo)準（0標(biāo)準）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標(biāo)準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準曲線的繪制與計算
以標(biāo)準品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以喹諾酮類標(biāo)準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準曲線中，從標(biāo)準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。
八、 注意事項
- 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準的OD值偏低。
- 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
- 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
- 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
- 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
- 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
- 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
- 該試劑盒理想反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
- 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
- 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
