HiFiScript cDNA第--鏈合成試劑盒說明書
HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit
HiFiScript cDNA第--鏈合成試劑盒
目錄號：K2569
保存條件：-20℃保存。
組分說明
Size 25 100
HiFiScript，200 U/μl 25 μl 100 μl
5×RT Buffer 120 μl 500 μl
Primer Mix 60 μl 240 μl
dNTP Mix，2.5 mM Each 120 μl 500 μl
DTT，0.1 M 60 μl 240 μl
RNase-Free Water 1 ml 1 ml
本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途
產(chǎn)品簡介
本產(chǎn)品是專為兩步法RT-PCR第--步實驗配制的cDNA第--鏈合成試劑盒。該試劑盒中使用的HiFiScript逆轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV由來的新型高效逆轉(zhuǎn)錄酶，新穎突變位點大幅提升酶的轉(zhuǎn)錄活性， cDNA第--鏈合成的效率和產(chǎn)量更高，可利用 pg級的總 RNA或mRNA合成cDNA第--鏈。點突變消除RNase H活性，酶的延伸性能提高，有效改善逆轉(zhuǎn)錄酶與RNA模板的親和力，可獲得長至12 kb的cDNA。精心優(yōu)化的RT Buffer使逆轉(zhuǎn)錄酶應(yīng)用范圍更廣，對后續(xù)的 PCR以及定量PCR實驗兼容性高。該試劑盒配備所有逆轉(zhuǎn)錄試劑，使用簡單方便。適用于第--鏈cDNA的合成和后續(xù)的RT-PCR、RT-qPCR，以及全長cDNA文庫的構(gòu)建等。
產(chǎn)品特點
1．高效的逆轉(zhuǎn)錄效率：新穎突變位點大幅提升酶活性能，獲得更高產(chǎn)量的cDNA。
2．良好的延伸能力：點突變消除RNase H活性，改善逆轉(zhuǎn)錄酶與RNA模板的親和力，可獲得長至12 kb的cDNA。
3．靈敏度高：可利用pg級的總RNA或mRNA模板合成cDNA第--鏈。
4．使用方便：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中已配備所有逆轉(zhuǎn)錄試劑，僅需準備模板即可輕松完成逆轉(zhuǎn)錄。
注意事項
1．在操作過程中應(yīng)避免RNase污染，防止RNA降解或?qū)嶒炛械慕徊嫖廴?，建議在專門的區(qū)域進行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)常更換手套。
2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應(yīng)使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃處理12小時，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應(yīng)使用 0.1%的DEPC處理后進行高壓滅菌。
3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心后使用。所涉及的酶類使用后應(yīng)盡快放回-20℃，避免反復凍融。
4．若起始RNA的量小于50 ng，建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：K0596。
使用方法
注意：1 ng-5 μg總RNA可建立20 μl反應(yīng)體系，如果總RNA量大于5 μg，請按比例擴大反應(yīng)體系。
逆轉(zhuǎn)錄操作步驟：
1．將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free
Water溶解并置于冰上備用。
2．根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系，總體積為20 μl。
試劑 20 μl反應(yīng)體系 終濃度
dNTP Mix，2.5 mM Each 4 μl 500 μM Each
Primer Mix 2 μl
RNA Template X μl 50 pg-5μg
5×RT Buffer 4 μl 1×
DTT，0.1 M 2 μl 10 mM
HiFiScript，200 U/μl 1 μl
RNase-Free Water up to 20 μl
注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：K0596。
2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。
3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
4．42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。
5．逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)，或置于-20℃長期保存。
ii 若逆轉(zhuǎn)錄效率低，或RNA模板二級結(jié)構(gòu)復雜、GC含量高時，建議采用以下步驟：
1．將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free
Water溶解并置于冰上備用。
2．根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系，總體積為13 μl。
試劑 20 μl反應(yīng)體系 終濃度
dNTP Mix，2.5 mM Each 4 μl 500 μM Each
Primer Mix 2 μl
RNA Template X μl 50 pg-5μg
RNase-Free Water up to 13 μl
3．70℃孵育10分鐘，迅速冰浴2分鐘。
4．短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
5．繼續(xù)向以上反應(yīng)液中加入以下試劑：
試劑 20 μl反應(yīng)體系 終濃度
5×RT Buffer 4 μl 1×
DTT，0.1 M 2 μl 10 mM
注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：K0596。
2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配制而成。
6．輕輕吹打混勻，42℃孵育2分鐘。
7．加入1 μl HiFiScript（200 U/μl），輕輕吸打混勻。42℃孵育50分鐘。
8．85℃孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。
9．逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于 PCR反應(yīng)和熒光定量 PCR反應(yīng)，加入量應(yīng)小于 PCR反應(yīng)體系的1/10，或置于-20℃長期保存。
