鏈霉素
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物鏈霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗鏈霉素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物鏈霉素的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物鏈霉素的含量。
二、試劑盒特性
- 試劑盒靈敏度： 0.1ppb
- 孵育溫度： 37℃
- 孵育時間： 30min～30min～15min
- 樣本檢測下限
雞 肉 ·············································· 1 ppb
雞肝、牛奶 ······································ 4 ppb
蜂 蜜/蜂王漿 ··································· 2 ppb
- 交叉反應(yīng)率
鏈霉素 ·········································· 100%
慶大霉素 ······································· ﹤0.1%
雙氫鏈霉素 ···································· 108%
卡那霉素 ······································· ﹤0.1%
- 樣本回收率
牛 奶 ···································· 85±22%
雞肉組織 ···································· 80±22%
蜂蜜/蜂王漿 ······························ 75±22%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔，一板12條 | |
2 | 標準液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 0.1ppb |
0.4ppb | 1.6ppb | ||
6.4ppb | 25.6ppb | ||
3 | 酶標記物 | 12ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 10X濃縮復(fù)溶液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱、恒溫水浴鍋
微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：氫氧化鈉、乙腈、正己烷、三氯yi酸
五、樣本前處理步驟
- 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
- 樣本前處理需配制：
配液1 0.5%三氯yi酸溶液
取0.5g三氯乙suan加去離子水定容100ml。
配液2 3%三氯乙suan溶液
取3g三氯乙suan加去離子水定容100ml。
配液3 1M NaOH溶液：
稱4g NaOH加去離子水定容至100ml。
配液4 0.1M NaOH溶液：
稱0.4g NaOH加去離子水定容至100ml。
配液5 樣本復(fù)溶液：
將10X濃縮復(fù)溶液用去離子水1：9稀釋。
- 樣本處理：
（a）牛奶處理方法
- 取牛奶1ml，按1:39稀釋，混合30s。（50µl牛奶+1950µl樣本復(fù)溶液）
- 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 40倍
（b）雞肉處理方法
- 取2±0.05g去除脂肪的勻漿樣本,加4ml 3%三氯yi酸，充分混勻2min； 室溫4000r/min以上，離心10min；
- 取上清液100µl，加入100µl0.1M NaOH，再加入300 µl樣本復(fù)溶液，充分混勻；
- 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 10倍
（c）雞肝處理方法
- 取2±0.05g去除脂肪的勻漿樣本,加6ml 0.5%三氯yi酸和2ml乙腈，充分混勻5min；
- 室溫4000r/min以上，離心10min；
- 取2ml上清液加入2ml正己烷，充分混勻靜置3min，取0.5ml下層清亮液體，室溫4000r/min以上，離心5min；
- 取50µl下層清亮液（若有分層，須去除掉上層液體取下層清亮液體），加入450µl樣本復(fù)溶液混勻，混合30s；
- 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 40倍
（d）蜂蜜、蜂王漿處理方法
- 稱量1±0.05g 樣本加入2ml 去離子水，振蕩至*溶解；
- 室溫4000r/min以上離心10 min。
- 取100µl上清液，加入400µl樣本復(fù)溶液混勻，混合30s；
- 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 10倍
六、 酶標免疫分析程序:
- 測定前應(yīng)須知：
- 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
- 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
- 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
- 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
- 操作步驟：
- 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
- 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
- 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
- 編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
- 加標準品/樣本50µl /孔，然后加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
- 倒出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。加入250µl/孔洗滌液，15-30s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次。
- 酶標記物：加入酶標記物100µl/孔，用蓋板膜封板，37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。取出酶標板，如前述洗板5次。
- 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色15min。
- 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含鏈霉素量成負相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.4ppb為1.415；1.6ppb為0.74；6.4ppb為0.313；25.6ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是6.4ppb～25.6ppb；樣本2的濃度范圍是0.4ppb～1.6ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中鏈霉素實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第—個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以鏈霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中鏈霉素實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。
八、 注意事項
- 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。
- 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
- 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
- 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
- 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
- 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
- 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
- 該試劑盒jia反應(yīng)溫度為37℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
- 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。
- 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
實驗代做服務(wù)：
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