乳酸（LA）含量檢測試劑盒說明書微量法
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
規(guī)格：100T/48S
產品內容：
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加入0.6ml試劑一充分溶解?？煞盅b后-20℃保存， 避免反復凍融；
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加入6mL試劑一充分溶解；可分裝后-20℃保存，避免反復凍融；
試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。 臨用前每瓶加入6mL 試劑一混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復凍融；
試劑五：液體3mL×1瓶，4℃保存。
標準品：粉劑×1支，4℃保存。臨用前加入1.04mL提取液配成100µmol/mL 的標準溶液；
顯色液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑三（V）：試劑四（V）：試劑五（V）=1：1：0.5的比例充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；
產品說明：
乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質代謝及細胞內能量代謝密切相關，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時使NAD+還原生成NADH和H+，H+傳遞給PMS生成的PMSH2還原特異性底物， 在450nm處有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器：
天平、研缽/勻漿器、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、乙醇和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理：
- 組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min后取上清待測。
b. 細胞：按照細胞數(shù)量（106個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃， 12000g離心10min后取上清待測。
c. 血清（漿）：取100µL血清（漿）加入0.9mL提取液，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
二、測定操作
1、分光光度計/酶標儀預熱30min，波長調至450nm，分光光度計用蒸餾水調零。
2、標準液的稀釋：將100µmol/mL 的標準溶液用蒸餾水稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0µmol/mL的標準溶液待測。
3、加樣表：
| 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
樣品（µL） | 10 | 10 | - | - |
標準品（µL） | - | - | 10 | - |
蒸餾水（µL） | - | 10 | - | 10 |
試劑一（µL） | 40 | 40 | 40 | 40 |
試劑二（µL） | 10 | - | 10 | 10 |
工作液（µL） | 140 | 140 | 140 | 140 |
于 37℃準確反應 30min。于 450nm 處測定吸光值，分別記為 A 測定管，A 對照管，A 標準管，A 空白管，計算?A 測定=A 測定管-A 對照管；?A 標準= A 標準管-A 空白管。 | ||||
三、乳酸含量的計算：
1、標準曲線的繪制
以各標準溶液濃度為x軸，以其對應的吸光值（?A標準）為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程
y=kx+b，將?A測定帶入公式中得到x（µmol/mL）。2、乳酸含量計算
（1） 按照蛋白含量計算
LA含量（µmol/mg prot）=x×V 樣÷V 樣÷Cpr =x÷Cpr
（2） 按照樣本質量計算
LA含量（µmol/g 鮮重）=x×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)=x ÷W。
（3） 按照細胞數(shù)量計算
LA含量（µmol/106 cell）=x×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量)=x ÷細胞數(shù)量
（4） 按照液體體積計算
LA含量（µmol/mL）= 10×x。
V樣品：加入的樣品體積，0.01mL。：W：樣本質量，g/mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL， 蛋白濃度需自行測定； V提取液：加入的提取液體積，1mL；細胞數(shù)量，5×106個；V液體：液體樣本體積，0.1mL。
注意事項：
1. 若測定吸光值?A大于最大濃度標準品OD值，請將樣品體積進行適當?shù)南♂尯?/font>
再進行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
實驗代做服務：
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